Untuk melakukan proses restriksi lambda DNA dengan 2 enzim atau double digestion menggunakan enzim EcoRI dan HindIII dilakukan dengan beberapa langkah. Pertama adalah menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Alat yang digunakan adalah microtube, mikropipet, tip mikropipet, mikrocentrifuge, dan waterbath 37˚C. Sedangkan bahan yang digunakan adalah lambda DNA, enzim restriksi EcoRI dan HindIII, larutan buffer, loading dye, gel agarose 1%, distilled water, dan Ethidium bromide. Setelah alat dan bahan disiapkan, selanjutnya adalah menyiapkan 1 mikrotube yang di dalamnya diisi dengan 10 µL lambda DNA, 5 µL enzim EcoRI, 5 µL enzim HindIII, dan 20 µL larutan buffer. Kemudian dalam microtube tersebut ditambahkan air murni sebanyak 160 µL hingga volume totalnya adalah 200 µL. Larutan dalam microtube tersebut kemudian dihomogenkan dengan cara dicentrifuge ataupun juga dapat diketuk dengan jari tangan.
Selanjutnya, sampel dalam microtube tersebut yang telah terisi lambda DNA dan enzim restriksi kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37˚C. Setelah selesai diinkubasi, dilakukan elektroforesis pada sampel untuk melihat pita-pita DNA-nya. Untuk keperluan elektroforesis digunakan gel agarose dengan konsentrasi 1%. Cara membuat gel agarose 1% adalah dengan mencampurkan 1 gram agarose dengan 99 µL air steril kemudian dipanaskan dan didiamkan selama 1-5 menit agar gel menggumpal. Kemudian memasukkan 10 µL sampel DNA dan 2 µL loading dye ke dalam sumuran gel agarose dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm dengan menggunakan mikropipet.
Selanjutnya proses elektroforesis dapat dimulai. Kabel dari sumber arus dihubungkan ke tangki elektroforesis, kemudian mengatur volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 80 V dan 30 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. Kemudian elektroforesis dapat dijalankan dengan cara menekan tombol RUN pada sumber arus. Pada saat proses elektroforesis berlangsung, dapat diamati pergerakan fragmen dari ujung katoda (hitam) ke ujung anoda (merah) pada chamber elektroforesis.
Setelah proses elektroforesis berhenti, gel dikeluarkan dan direndam dalam larutan Ethidium bromida 10 menit kemudian dengan air 5 menit. Perlu diperhatikan bahwa Ethidium bromida bersifat karsinogenik, sehingga diperlukan kehati-hatian saat menggunakannya. Kemudian gel diletakkan di atas UV transluminator dan dinyalakan UV-nya, kemudian diamati pita-pita tervisualisasi dan ukurannya.
0 Comments